步骤二：

标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50ul。

步骤三：

样本孔中加入待测样本50ul；空白孔不加。

步骤四：

每孔加入生物素标记抗体50ul，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育30分钟；标准孔空白孔不加。

步骤五：

弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350ul），静置1分钟，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

步骤六：

除去空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100ul，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育30分钟。

步骤七：

重复步骤五

步骤八：

每孔加入底物A、B各50ul，37℃避光孵育15分钟。

步骤九：

每孔加入终止液50ul，15分钟内在450nm波长处测定各孔的OD值。