PKH26试剂盒 细胞膜、囊泡、外泌体标记

产品简介

PKH26试剂盒采用膜标记探针，能够将带有较长脂质尾巴的黄色-橙色荧光染料（PKH26）结合到细胞膜脂质区域。PKH26荧光在黄色-橙色区域（图1），激发波长为551nm，发射波长是567nm，与罗丹明或PE检测系统兼容。PKH26体内半衰期长，超过100天。由于其荧光稳定性较强，PKH26被用于体内细胞追踪研究，特别是在标记细胞的研究周期超过一周时。试剂盒中提供染色所需的溶剂Diluent C，该溶剂可以增加染料溶解度和染色效率，同时维持细胞活力。Diluent C与哺乳动物细胞等渗，且不含去垢剂或有机溶剂，也不含生理盐和缓冲剂。

本试剂盒主要用于常规细胞膜、囊泡、外泌体的标记，体外细胞增殖的研究以及长期体内细胞示踪的研究等。同时也可用于细胞毒性分析，监测外来病毒、血小板和其他纳米颗粒的摄入，干细胞分裂过程中膜的分配，细胞-细胞之间膜的转移，细胞吞噬作用，抗原呈递，黏附，通过间隙连接的信号传递，以及组织切片中的神经元迁移等。

注：本试剂盒分别对应Sigma的MINI26、MIDI26、PKH26GL试剂盒，效果相当，且本试剂盒提供足量的Diluent C，而Sigma仅提供少量Diluent C。当使用2 mL染色体积（含2×10^-6 M终浓度的PKH26），100 μL、200 μL、500 μL规格的试剂盒可分别用于进行25次、50次、125次细胞样本（2×10⁷个细胞/次）的检测和至少50次、100次、250次外泌体样本的标记。

产品组分

*1×10^-3 M in ethanol

保存条件

2～8℃避光保存，1年有效。其中PKH26 Dye需拧紧盖子，以防挥发。

注意事项

1．本品PKH26用乙醇溶解，可室温或冷藏保存。储存过程中需避光并拧紧盖子，防止溶液挥发引起的染料浓度提高。使用前需检查是否有结晶，若有结晶，需在37℃水浴溶晶，超声或涡旋直至完全溶解。

2．Diluent C可室温或冷藏保存。使用前复温至室温。Diluent C为无菌溶液，不含防腐剂或抗生素，使用和保存过程中都需保持无菌。

3．不要将PKH26储存于Diluent C内。溶于Diluent C的染色工作液需现配现用，且配好后需立即使用。

4．荧光染料均存在淬灭问题，操作和储存过程中需注意避光，以减缓荧光淬灭。

5．本产品用于科学研究。

6．为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明

一、常规细胞膜的标记

操作注意：

在实验过程中需要探索合适的染色条件，染料浓度过高和染色时间过长会导致细胞膜完整性缺失和细胞复原能力降低。下述步骤适用于体内/体外标记干细胞、淋巴细胞、单核细胞、内皮细胞、神经元或其他细胞。而体内标记、血小板标记、或选择性标记吞噬细胞，需对步骤做适当修改。

 需在其他单克隆抗体染色前进行PKH26染色。因为4℃进行其他单克隆抗体染色对PKH26荧光没有显著影响。但是，如果单抗染色后再室温进行PKH26染色，很可能覆盖单抗染色。

 下述步骤中推荐的细胞和染料浓度适用于多种细胞。当然，用户可根据自身细胞类型和实验目的确定佳的染料和细胞浓度，通过对染色后细胞活力（如，PI染色），荧光强度，染色均匀度以及是否对细胞功能有影响等方面来综合评估。

 PKH26染色过程中需避免存在叠氮化物或代谢毒物。

 虽然贴壁细胞也可以染色，但单细胞悬液染色均一性更佳。因此，用蛋白酶（如，胰酶/EDTA）将贴壁细胞消化为单个悬浮细胞后再染色效果更好。

操作流程：

以下步骤染液终体积为2 mL，其中PKH26的浓度为2×10^-6 M，细胞浓度为1×10⁷ cells/mL。

以下步骤均在室温下进行（20～25℃）。

1．将含有2×10⁷ cells的悬液用无血清培养基或缓冲液洗涤一次。

注：血清蛋白和脂质会与染料结合，降低与细胞膜结合的染料浓度。

2．400 g离心5 min获得细胞团。

注：不要将PKH26 Dye直接加到细胞沉淀上，会造成细胞染色不均一和细胞活力降低。

3．离心后，小心吸弃上清，残余液体不超过25μL。

注：为了得到可重复的实验结果，在用Diluent C重悬细胞时，减少残留培养基或缓冲液非常重要。

4．加1 mL Diluent C，用移液枪轻轻吹打混匀，制备成2×细胞悬液。不要涡旋，不要让细胞长时间保存在Diluent C中。

注：生理盐会导致染料结团并大幅降低染色效率。因此，染色时需将细胞悬浮于Diluent C中，而不是培养基或缓冲盐溶液中。

5．染色前，将4 μL PKH26 Dye加入1 mL Diluent C中，充分混匀，获得2×染液（4×10^-6 M）。

注：①为了减少乙醇对细胞活力的影响，步骤6中乙醇终浓度不能超过1～2%。

    ②如果希望终染料浓度< 2×10^-6 M，将PKH26 Dye用无水乙醇稀释佳。

6．快速将1 mL 2×细胞悬液（步骤4）加入1 mL 2×染液（步骤5）中，立即用移液枪混匀。PKH26的浓度为2×10^-6 M，细胞浓度为1×10⁷ cells/mL。

注：①由于染色几乎是瞬时的，所以需要立即混匀，用吸管混匀或者涡旋混匀等方式混合较慢，容易造成染色不均。

②不要将PKH26 Dye直接加到2×细胞悬液中。

③将2×细胞悬液和2×染液等体积混匀。

④调整2×细胞悬液和2×染液的体积，不要过小（< 100 μL），也不要过大（> 5 mL）。

⑤尽可能加样体积，以保证样品与样品之间，实验与实验之间的可重复性。

7．孵育1～5 min，中间定期混合。因为染色非常迅速，不要长时间染色。

注：在保证获得理想染色强度下，让细胞在染色液中停留尽量短的时间。因为Diluent C不含生理盐，长时间暴露在Diluent C中会造成某些细胞活力降低。如果不能确定PKH26染色对实验细胞有无影响，可以设置一个仅用无血清培养基或缓冲液稀释细胞的空白对照组，和一个使用Diluent C稀释细胞但是将PKH26 Dye换为乙醇（因为PKH26用乙醇溶解）的阴性对照组。

8．加入等体积的血清（2 mL）或其他合适的蛋白溶液（如1% BSA）终止反应，孵育1 min以结合多余的染料。

注：①血清（或等效的蛋白溶液）为优的终止液。如果用完全培养基替代，添加体积提高至10 mL。

②不要加Diluent C终止染色，或让细胞在Diluent C中离心。

③不要使用无血清培养基或缓冲液，它们会使染料结团。染料聚合物无法通过洗涤有效去除，在后续实验中会转移到未标记的细胞上，干扰实验结果。

9．细胞在20～25℃，400 g离心细胞10 min，小心吸弃上清。用10 mL完全培养基重悬细胞，将重悬液转移至新的无菌离心管中，20～25℃，400 g离心5 min。用10 mL完全培养基再清洗两遍，以去除未结合的染料。

注：①将重悬液转移至新的离心管中，减少离心管壁残留的染料对洗涤效率的影响。

②不要用Diluent C清洗。

10．后一步清洗后，（可选：用10 mL完全培养基重悬细胞，评估细胞回收率，细胞活力和荧光强度（如图2）），离心并重悬细胞至所需的浓度。

注：①染色后的细胞可用1～2%中性甲醛固定，避光条件下，荧光强度至少3周内保持稳定。

②染色荧光强度一般为背景的100～1000倍。虽然染色的细胞活力与细胞种类有关，但荧光分布应该尽量均匀对称。

二、外泌体的标记（与囊泡标记相似）

操作流程：

以下步骤染液终体积为1 mL，其中PKH26的浓度为2×10^-6 M。

1．将外泌体浓缩液用Diluent C补齐至500 μL，用移液枪轻轻吹打混匀，制备成2×外泌体溶液。

注：①生理盐会导致染料结团并大幅降低染色效率。因此，染色时需将外泌体溶于Diluent C中，而不是培养基或缓冲盐溶液中。②可将新鲜提取的外泌体直接用Diluent C溶解后，立刻进入PKH26标记实验。或者尽量用少量的缓冲液（< 25 μL）溶解外泌体，避免引入过量的生理盐。③不要将PKH26 Dye直接加到外泌体中，会造成染色不均一。

2．将2 μL PKH26 Dye加入500 μL Diluent C中，充分混匀，获得2×染液（4×10^-6 M）。

注： 如果希望终染料浓度< 2×10^-6 M，将PKH26 Dye用无水乙醇稀释佳。

3．快速将500 μL 2×外泌体溶液（步骤1）加入500 μL 2×染液（步骤2）中，立即用移液枪混匀。终PKH26的浓度为2×10^-6 M。

注：由于染色几乎是瞬时的，所以需要立即混匀，用吸管混匀或者涡旋混匀等方式混合较慢，容易造成染色不均。

4．孵育1～5 min，中间定期混合。因为染色非常迅速，不要长时间染色。

5．加入等体积的无外泌体的血清（1 mL）或其他合适的蛋白溶液（如1% BSA）终止反应，孵育1 min以结合多余的染料。

注：①不要加Diluent C终止染色。

②不要使用无血清培养基或缓冲液，它们会使染料结团。染料聚合物无法通过洗涤有效去除，在后续实验中会转移到未标记的细胞上或者外泌体上，干扰实验结果。

6．用外泌体提取的方法重新提取外泌体，用PBS清洗，并重新提取外泌体后用合适的缓冲液重悬外泌体待用。

图3 肝细胞系L02摄取PKH26标记的外泌体

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