飞凡检测可依据YY/T 0606.25-2014 进行动物源性生物材料DNA残留量测定法:荧光染色法试验,动物源性生物材料DNA残留量测定法:荧光染色法试
YY/T 0606.25-2014标准试验过程解析
飞凡检测试验步骤:
本试验方法所采用的实验方案包括三个步骤:(1)动物源性生物材料的蛋白酶K消化(适用于固体或胶体状材料),(2)消化后样品的DNA纯化(磁珠吸附法),(3)纯化后样品的 DNA 残留量测定(荧光染色法)。试验样品除供试品之外,需同步设定回收率试验样品(使用标准品Lambda DNA)。
材料:试剂和仪器
准备:
试剂:1(蛋白酶K消化用试剂:蛋白酶K(-20?保存,避免反复冻存和融化),蛋白酶K
缓冲液。 2(DNA纯化用试剂:磁珠(4?保存)、裂解液、DNA结合液、漂洗液、溶出液(室温保存)。3(荧光染色法检测试剂:PicoGreen 染料。
仪器:磁力架,96 孔板(黑色),荧光酶标仪,DNase-free无菌离心管;吸头,冷冻离心机,震荡器,漩涡混悬器,高精度天平(0.00001g)
飞凡检测试验步骤:
注明:以下试验过程中必须采取防止 DNAase 污染的措施,如:戴手套操作、使用没有 DNAase 污染的专用实验台和实验用具及仪器。
1.干燥型样品:取供试品(100 ug),jingque称重并记录,放进1.5 mL DNase-free无菌离心管内,用无菌眼科剪将样品剪裁成适当大小,加 DEPC水至180UL,于冰箱内放置 12,24 小时,使样品充分水和、软化。
2.湿润型样品:取供试品(1 cm),放于1.5 mLDNase-free无菌离心管内.13000rpm/min 离心10 min,去除液体部分。另取与上述同样大小的样品,分别放于1.5mLDNase-free无菌离心管内,13000rpm/min离心10min,去除液体部分后以开盖状态放在安全柜内,令其室温内自然干燥24 小时,然后jingque称重并记录,用于样品干重单位重量内DNA残留量的计算。
3.胶体型样品:jingque量取供试品 100 uL,放于1.5 mLDNase-free无菌离心管内,可直接进行下一步实验。
注:胶体型样品:以单位体积的残留 DNA 含量表示最终结果。
4. 骨质类样品:对于诸如同种异体骨等骨植入物样品应参照GA/T 383-2002中华人民共和国公共安全
注:每份样品设平行样三份,最终测定结果取其平均值。
5.将上述供试品剪成尽量小的碎片后,加蛋白酶K缓冲液(10xProteinase K buffer)20uL,蛋白酶K(20mg/mL)10uL,加DEPC水至最终反应体积为210u L。
注:液态状样品不需要蛋白酶K消化,可直接进行后续的 DNA 纯化试验。
6.取DNA 标准品(Lambda DNA standard)400ng、200ng、100ng、50ng、25ng、Ong,用DEPC水稀释至100uL,分别加在1.5 mLDNase-free无菌离心管内,添加蛋白消化酶K缓冲液20u L,蛋白酶K(20 mg/mL)10u L,3% BSA 80uL(目的是保证与供试品反应系统相同),至最终反应体积为 210uL。
7.依据所选择的方法及使用的试剂盒所附的操作方法进行 DNA纯化。
TMTM 举例:使用 PrepSEQ核酸提取试剂盒(PrepSEQ Nucleic Acid Extraction
Kit)进行DNA纯化 , 在上述各样品中分别加入裂解液 400uL,震荡10秒钟使样
品充分混匀,室温放置10min,使样品完全溶解(最多可放置 1-2 小时,直至样品完全溶解)。
8.取出装有磁珠的离心管,以“最大速度”震荡 10 秒钟混匀后,取30uL磁珠液分别加入上述各样品内,“低速”震荡 10 秒钟混匀。加入 400u L结合液(异丙醇),震荡5秒钟。室温下震荡(1000 rpm/min)孵育10分钟。再次低速震荡 10 秒钟后,将内装样品的离心管放在磁力架上,收集结合有DNA 的磁珠,去除上清液。 漂洗 DNA:加入300uL洗液,低速震荡10秒钟后,将内装样品的离心管放在磁力架上,收集结合有 DNA的磁珠,去除上清液。
9.重复步骤:漂洗DNA,至少2次。使结合有 DNA 的磁珠在室温下干燥5分钟。溶出DNA:加入50uL溶出液,中速震荡5分钟,于70度水浴槽内孵育5分钟,中速震荡2秒钟后,将内装样品的离心管放在磁力架上,分离 DNA。
飞凡检测数据分析
本试验方法中回收率试验最低样本量为 6.25 ng DNA,低于6.25 ng 时回收率明显下降,不能满足良好的准确性和精密度。因此,本试验方法中适宜的样本量为?6.25 ng DNA/样品。若样品中 DNA残留量低于 6.25 ng DNA/样品时,应加大样品的取样量,同时相应地扩大蛋白酶K消化时的反应体积。
如果在最大取样量的条件下仍不能满足上述条件,则只能报告未经回收率校正的检测值作为参考资料,此种情况在最终报告中应注明。