蛋白磷酸化检测首先要明确该蛋白样品是否发生磷酸化修饰，如有磷酸化修饰，那么再分析发生磷酸化的氨基酸位点以及发生磷酸化的肽段含量。目前蛋白质磷酸化分析的方法主要有放射性标记法（32P）、免疫印迹法、荧光染色法和质谱法等。
放射性标记法先用32P标记ATP，通过细胞代谢标记到磷酸化蛋白质上，再经一维或二维凝胶电泳或色谱法进行分离，zuì后通过放射自显影进行检测。
免疫印迹法基于抗体特异性结合抗原的原理，利用抗磷酸化氨基酸抗体与电泳分离得到的磷酸化蛋白质进行免疫印迹反应来检测磷酸化蛋白质。在实验中，通常将免疫印迹与免疫沉淀结合使用，因为磷酸化蛋白质的含量较低，先利用免疫沉淀法对磷酸化蛋白质进行富集，可以降低非磷酸化蛋白质的干扰。
荧光染色法利用荧光染料直接对凝胶中结合在酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基上的磷酸进行选择性染色，再通过荧光扫描仪检测就能直接鉴别出磷酸化的蛋白质。
质谱法首先将含磷酸化修饰的蛋白样品进行酶切，然后对酸化肽段进行富集，再将富集得到的磷酸化肽段进行串联质谱分析，zuì后利用质谱数据结合生物信息学分析对磷酸化蛋白质进行鉴定。
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