| 类型 : | 其他生物化工 |
镍-琼脂糖凝胶FF（IDA）
（Ni-Berpharose FF-IDA）
1. 产品介绍
镍-琼脂糖凝胶FF以琼脂糖微球为基质，活化偶联亚氨基二乙酸（IDA），之后螯合Ni2+。
IDA是金属螯合层析中最常用的配体，和次氮基三乙酸（NTA）相比，IDA具有亲和力强、载量高、可再生重复使用等优点。
镍-琼脂糖凝胶FF主要用于纯化含有组氨酸标签（His-Tag）的重组蛋白。
组氨酸标签中的咪唑环同过渡金属Ni2+形成稳定的配位键，能特异、牢固和可逆地吸附在固定有Ni2+的基质上，可通过增加咪唑浓度对重组蛋白进行竞争洗脱。
2.规格
1ml（预装柱）、5ml（预装柱）、10ml（预装柱）、20ml、100ml、500ml
3.产品性能
性能 | 指标 |
基质 | 6%琼脂糖微球 |
配基 | Ni2+ |
载量 | ≥40mg His标签蛋白/ml |
粒径 | 45-165μm |
推荐流速 | 50-300 cm/h |
耐压 | 0.3MPa |
工作温度 | 4-40℃ |
pH稳定范围:正常/脱镍 | 5-12/3-14 |
储存缓冲液 | 20%乙醇 |
储存温度 | 4-8℃ |
4.纯化流程
①平衡
镍-琼脂糖凝胶FF柱用2-5个柱体积的初始缓冲溶液进行平衡。
建议流速为100 cm/h。
②上样
（1）样品一般溶解于pH6-8的初始缓冲液中。
提高上样缓冲液的pH值可以增大载量。
（2）缓冲液中不能含有EDTA和柠檬酸盐，同时避免巯基乙醇、DTT等还原剂。
（3）常用缓冲液有10-100 mM磷酸钠缓冲液、20-200 mM Tris-HCl缓冲液等。
（4）缓冲液中一般要加入0.15-0.5 M的NaCl以消除离子交换作用。
（5）初次使用镍-琼脂糖凝胶FF时，推荐使用50 mM PBS（50 mM NaH2PO4、0.5 M NaCl、pH 7.4）作为初始缓冲液。
③洗脱
（1）增加咪唑浓度进行洗脱是镍-琼脂糖凝胶FF最常用的洗脱方法。
（2）咪唑为碱性，相应缓冲液配制后需要用HCl调节pH值。
（3）初次使用镍-琼脂糖凝胶FF时，如不确定洗脱需要的咪唑浓度，推荐在初始缓冲液中分别加入10 mM、20 mM、50 mM、100 mM、200 mM、500 mM咪唑，浓度从低
到高分别洗脱和收集重组蛋白，之后通过SDS-PAGE电泳等方法鉴定洗脱结果。
（4）有条件的可以进行咪唑梯度线性洗脱以确定较佳的洗脱条件。
洗脱方法：
（1）降低pH洗脱：大多数蛋白在pH4-6会被洗脱下来（也可以在pH 3~4），缓冲液可以是醋酸钠、柠檬酸和磷酸盐缓冲体系。
（2）竞争性洗脱：线性增加或一步增加同金属离子有亲和力的竞争物质的浓度（如0-0.5M咪唑、0-50 mM组氨酸、0-2M NH4Cl）。
梯度洗脱在起始缓冲液的恒定pH值下进行。
（3）螯合剂洗脱：EDTA、EGTA等螯合剂可同金属离子产生作用力，导致蛋白被洗脱下来。
此法不能分离不同的蛋白，还会影响蛋白的吸附，导致融合蛋白无法挂柱。
注：降低pH洗脱和螯合剂洗脱会使得金属离子脱落，下次使用前需要重新螯和金属离子。
最常用的方法为竞争性洗脱。
上述洗脱方法，均须在缓冲液中加入150 -