第yi代腺病毒载体:一般将E1或E3基因缺失的腺病毒载体称为第yi代腺病毒载体,此类型载体在未经过纯化时可引发机体产生较强的炎1症反应和免1疫反应,纯化后可以安全使用,体内表达周期可达4周。
第二代腺病毒载体:E2A或E4基因缺失的腺病毒载体被称为第二代腺病毒载体,产生的免1疫反应较弱其载体容量和安全性方面有所改进,但病毒包装难度和出毒和病毒滴度下降厉害,应用相当局限。
第三代腺病毒载体:第三代载体缺失了全部的(无病毒载体,gutless vector)或大部分腺病毒基因(微型腺病毒载体,mini Ad),仅可保留ITR和包装信号序列。第三代腺病毒载体zui大可插入35kb的基因,病毒蛋白表达引起的细胞免1疫反应进一步减少,载体中引入核基质附着区基因可使得外源基因保持长期表达,并增加了载体的稳定性。这一载体系统需要一个腺病毒突变体作为辅助病毒。
科学家在培养转基因植物时,常用什么中的质粒作为载体?
(1)具有较小的分子量。经验表明,为了避免在DNA的纯化过程中发生链的断裂,克1隆载体的分子大小建议不要超过10Kb。pBR质粒这种小分子量的特点,不仅易于自身DNA的纯化,而且可容纳较大的外源DNA部分片段;
(2)具有两种抗1菌素抗性基因可供作转化子的选择记号,能指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞以及外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子。标记基因往往可以赋予宿主细胞一种新的表型,这种转化细胞可明显地区别于非转化细胞。当我们把一个DNA部分片段插入到某一个标记基因内时,该基因就失去了相应的功能。当把这种重组DNA分子转到宿主细胞后,该基因原来赋予的表型也就消失了。要是仍保留了原来表型的转化细胞,细胞内含有的DNA分子一定不是重组子。很显然,既要指示外源DNA是否进入了宿主细胞,又要指示载体DNA分子中是否插入了外源DNA部分片段,那么这种载体必须至少具有两个标记基因。另外,pBR质粒载体还具较高的拷贝数,逆转录病毒滴度测定,而且经过氯霉1素扩增之后,每个细胞中可积累1000~3000个拷贝,这就为重组体DNA的制备提供了极大的方便。
典型的腺病毒载体系统如:穿梭质粒pCA13/腺病毒基因组质粒pBHG11/包装细胞293细胞。pCA13/的HCMV IE启动子-多克1隆位点-SV40 AN(poly A)构成外源基因的表达盒,该表达盒的插入使腺病毒E1基因缺失,但是保留其两端侧翼序列(左侧的1~3bp的ITR,右侧从3.5kb到末端的维持病毒装配和活力必须的蛋白IX的基因),也保留了腺病毒的包装信号
φ(194~358bp);pBHG11则保留了腺病毒基因组的绝大部分,但是缺失了包装信号φ、0.5~3.7图距(mu)部分的E1区、77.5~86.2mu的E3区,293细胞是整合有Ad5 E1基因的人胚shen细胞系。pBHG11因为缺失包装信号及E1区而不能copy,pCA13带有包装信号及E1的侧翼序列,但是缺失E1区及腺病毒绝大部分基因组,同样不能copy。外源目的基因插入pCA13后,与pBHG11共转染,进入293细胞。pCA13与pBHG11在细胞内发生同源重组,同时,293细胞提供E1蛋白,从而包装产生腺病毒颗粒。该病毒的蛋白质外壳同野1生型腺病毒相似,具有同样的感1染力进入靶1细胞的能力,但是基因组DNA的E1区被外源目的基因取代,即进入靶1细胞后病毒不能copy,但可以表达目的蛋白。
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