糖基化位点鉴定就是对糖链所结合的氨基酸种类以及该氨基酸残基在肽链中所处的位置进行鉴定，N糖基化的N型糖苷键对氨基酸序列有特殊要求，只与特定氨基酸序列中的的天冬酰胺的氨基结合，O型糖苷键可与任意氨基酸序列中的苏氨酸或丝氨酸的羧基结合。只要已知发生糖基化的类型，就可以确定其氨基酸种类，只需要进一步鉴定其所在肽链中的具体位置。
目前，糖基化氨基酸位点鉴定主要通过生物质谱技术结合专一性糖苷内切酶或蛋白酶的作用来开展。一般先对糖基化位点进行特异性标记，使之与未修饰的蛋白质之间存在特定的分子质量差异，再利用质谱技术检测这种差异，进而通过串联质谱技术鉴定在哪个氨基酸发生了糖基化。一般步骤包括糖蛋白的水解消化和标记、聚糖释放、液相色谱法分离富集糖肽、质谱检测以及数据分析。
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