错位切割含目的基因的DNA部分片段和运载体一形成黏性末端
单酶切：同一种限制酶分别切割含目的基因DNA部分片段与运载体。这是较简单的一种方法，含目的基因的DNA部分片段与运载体在同种限制酶作用下形成相同的黏性末端，这两个黏性末端间能通过碱基间的配对而连接，进而形成重组DNA分子。
用同裂酶去切割含目的基因DNA部分片段与运载体。有一些来源不同的限制酶识别核苷酸顺序和切割位置都相同，这类酶称为同裂酶(同切酶或异源同工酶)。同裂酶产生同样的切割，形成相同的黏性末端。
DNA部分片段的连接
DNA部分片段通过用每一种限制性内切酶过量消化底物DNA而获得。这些片段随后用T4 DNA连接酶连接( 5′末端浓度为0.1-1.0 μM)。连接的片段然后用同一种限制性内切酶重切。仅当3′和 5′末端都保留完整，连接反应才会发生;而且只有那些识别位点完全恢复的分子才能被重切。切割后正常的带型说明3′和 5′末端都是完整的，快切酶，而且准备的酶样品中检测不到核酸外切酶和磷酸酶。
DNA限制性内切酶酶切是一项基于DNA限制性内切酶的基因工程技术，其基本原理是利用限制性内切酶对DNA上特定序列的识别，来确定切割位点并实现切割，从而获得所需的特定序列。
生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。它是可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶（简称限制酶）。
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